La diferencia clave entre los ensayos de PCR en tiempo real y anidados convencionales es que la PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN y la PCR anidada es una modificación de la PCR convencional que consiste en dos reacciones de amplificación secuencial, mientras que la PCR real -time PCR es una variante de la PCR convencional que es capaz de cuantificar el producto amplificado.
PCR es una técnica científica muy común ampliamente utilizada en investigación y medicina para detectar ADN. Las pruebas de PCR se utilizan para detectar antígenos mediante la detección de su ADN o ARN. Generalmente, el ARN viral está presente en el cuerpo antes de detectar anticuerpos o mostrar los síntomas de la enfermedad. Una prueba de PCR puede decir si alguien tiene o no el virus desde el principio. Actualmente, la PCR es la prueba estándar para detectar la enfermedad de COVID-19. Existen diferentes tipos de técnicas de PCR, como PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR multiplex, PCR de inicio en caliente y PCR de largo alcance, etc.
¿Qué son los ensayos de PCR convencionales?
El ensayo de PCR convencional es una técnica de amplificación de ADN in vitro que se realiza de forma rutinaria en los laboratorios de biología molecular. Este método permitió la producción de miles a millones de copias de un fragmento de ADN en particular. Kary Mullis introdujo esta técnica en 1980. Esta técnica requiere un fragmento de ADN conocido como plantilla para hacer muchas copias de él. La polimerasa Taq funciona como la enzima ADN polimerasa y cataliza la síntesis de nuevas hebras de la secuencia molde.
Los cebadores en la mezcla de PCR funcionarán como puntos de partida para las extensiones de fragmentos. Todos los ingredientes que son necesarios para hacer copias de ADN están incluidos en la mezcla de PCR. La reacción de PCR se ejecuta en una máquina de PCR y debe alimentarse con la mezcla de PCR correcta y el programa de PCR correcto. Si la mezcla de reacción y el programa son correctos, producirá el número requerido de copias de una sección particular de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.
Figura 01: Ensayo de PCR convencional
Hay tres pasos principales involucrados en una reacción de PCR: desnaturalización, recocido del cebador y extensión de cadena. Estos tres pasos ocurren a tres temperaturas diferentes. El tampón PCR mantiene las condiciones óptimas para la acción de la polimerasa Taq. Estas tres etapas de la reacción de PCR se repiten para producir la cantidad requerida del producto de PCR. En cada reacción de PCR, el número de copias de ADN se duplica. Por lo tanto, la amplificación exponencial se puede observar en la PCR. El producto de la PCR se puede resolver mediante electroforesis en gel, ya que produce una cantidad visible de ADN en un gel, y se puede purificar para estudios posteriores, como la secuenciación.
PCR es una herramienta valiosa en la investigación médica y biológica. Especialmente en los estudios forenses, la PCR tiene un valor inmenso, ya que puede amplificar el ADN para estudios a partir de las pequeñas muestras de los delincuentes y hacer perfiles de ADN forense. La PCR se usa ampliamente en muchas áreas de la biología molecular, incluidas la genotipificación, la clonación de genes, la detección de mutaciones, la secuenciación de ADN, los microarrays de ADN y las pruebas de paternidad.
¿Qué son los ensayos de PCR anidados?
La PCR anidada es un tipo de PCR que reduce la amplificación no específica del ADN. Hay dos PCR sucesivas o dos reacciones de amplificación secuencial en el ensayo de PCR anidado. Durante la primera reacción de amplificación, se produce un producto de PCR. Después de la primera reacción, se realiza una segunda reacción de amplificación en el producto de PCR de la primera reacción. Por lo tanto, los cebadores de la segunda mezcla de reacción se unen al primer producto de PCR y lo amplifican.
Figura 02: PCR anidado
Los pares de cebadores son diferentes en cada reacción. La unión no específica de los cebadores se reduce en la PCR anidada. Los ensayos de PCR anidados son útiles para aumentar la sensibilidad y/o la especificidad. Sin embargo, la PCR anidada requiere conocimiento sobre la secuencia interesada.
¿Qué son los ensayos de PCR en tiempo real?
La PCR en tiempo real o la PCR cuantitativa (Q PCR) es una versión modificada de la PCR que mide cuantitativamente los productos de la PCR. Por lo tanto, esta técnica cuantifica la amplificación en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real. También es un método adecuado para determinar la cantidad de una secuencia diana o gen presente en una muestra.
La característica interesante de la PCR en tiempo real es que combina la amplificación y la cuantificación real en un solo paso. Por lo tanto, la técnica de PCR en tiempo real puede eliminar la necesidad de electroforesis en gel para la detección. El uso de colorantes fluorescentes para marcar los productos de la PCR durante las reacciones de la PCR conducirá finalmente a la cuantificación directa. Cuando se acumulan los productos de PCR, las señales fluorescentes también se acumulan y serán medidas por la máquina en tiempo real. SYBR Green y Taqman son dos métodos para detectar o observar el proceso de amplificación de la PCR en tiempo real. Ambos métodos monitorean el progreso del proceso de amplificación e informan la cantidad del producto en tiempo real.
Figura 03: PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real tiene una amplia variedad de aplicaciones, como la cuantificación de la expresión génica, el análisis de microARN y ARN no codificante, el genotipado de SNP, la detección de variantes en el número de copias, la detección de mutaciones raras, la detección de organismos modificados genéticamente y detección de agentes infecciosos.
¿Cuáles son las similitudes entre los ensayos de PCR anidados convencionales y en tiempo real?
- Los ensayos de PCR anidados y en tiempo real son modificaciones de los ensayos de PCR convencionales.
- Las tres técnicas amplifican muestras de ADN.
- Sus productos se pueden utilizar en secuenciación o análisis.
- Estos ensayos requieren cebadores.
¿Cuál es la diferencia entre los ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real?
La PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN. Por su parte, la PCR anidada es una modificación de la PCR convencional que consta de dos reacciones de amplificación secuenciales, y la PCR en tiempo real es una variante de la PCR convencional que es capaz de cuantificar el producto amplificado. Por lo tanto, esta es la diferencia clave entre los ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real. A diferencia de la PCR convencional y en tiempo real, la PCR anidada utiliza dos conjuntos de cebadores. Además, hay dos reacciones de amplificación sucesivas en la PCR anidada para reducir la amplificación no específica. además, los ensayos de PCR convencionales y en tiempo real no contienen dos reacciones de amplificación secuenciales.
La siguiente infografía enumera las diferencias entre los ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real en forma tabular para una comparación lado a lado.
Resumen: ensayos de PCR convencionales, anidados y en tiempo real
La PCR convencional es la primera técnica desarrollada para amplificar fragmentos específicos de ADN. La PCR anidada y la PCR en tiempo real son dos variantes de la PCR convencional. Hay dos reacciones de amplificación secuencial y el uso de dos conjuntos de cebadores en la PCR anidada. La PCR en tiempo real se desarrolla para cuantificar el producto de PCR amplificado. Por lo tanto, esto resume la diferencia entre los ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real.
