Diferencia clave: transferencia del norte, del sur y del oeste
La detección de secuencias específicas de ADN, ARN y proteínas es esencial para varios tipos de estudios en biología molecular. La electroforesis en gel es una técnica que separa el ADN, el ARN y las proteínas según sus tamaños. A partir de los perfiles de gel, se detectan secuencias de ADN, secuencias de ARN o proteínas particulares mediante técnicas especiales denominadas transferencia e hibridación con sondas marcadas. Hay tres tipos diferentes de métodos de transferencia: sur, norte y oeste. La diferencia clave entre la transferencia Northern Southern y Western radica en el tipo de molécula que detecta en una muestra. La transferencia Southern es un método que detecta una secuencia de ADN específica a partir de una muestra de ADN. La transferencia Northern es una técnica que detecta una secuencia de ARN específica a partir de una muestra de ARN. La transferencia Western es un método que detecta una proteína específica de una muestra de proteína.
¿Qué es el Southern Blotting?
La técnica de transferencia de Southern fue desarrollada por E. M. Southern en 1975 para la identificación de una secuencia de ADN específica a partir de una muestra de ADN. Esta es la primera técnica de transferencia introducida en biología molecular. Permitió la detección de genes específicos del ADN, fragmentos específicos del ADN, etc. Hay varios pasos involucrados en la técnica de transferencia de Southern. Son los siguientes.
- El ADN se aísla de la muestra y se digiere con endonucleasas de restricción.
- La muestra digerida se separa mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Los fragmentos de ADN en el gel se desnaturalizan en hebras simples mediante el uso de una solución alcalina.
- El ADN monocatenario se transfiere a una membrana de filtro de nitrocelulosa mediante transferencia capilar.
- El ADN transferido se fija a la membrana de forma permanente.
- El ADN fijado en la membrana se hibrida con sondas marcadas.
- El ADN no unido se elimina de la membrana mediante lavado.
- La película de rayos X se expone a la membrana y se prepara una autorradiografía.
La transferencia Southern se aplica a diferentes aspectos de la biología molecular. Es útil en el mapeo de RFLP, estudios forenses, metilación del ADN en la expresión génica, detección de genes mutados en trastornos genéticos, huellas dactilares del ADN, etc.
Figura 01: Técnica de transferencia Southern
¿Qué es el Northern Blot?
La transferencia de Northern es un método diseñado para detectar una secuencia de ARN específica o una secuencia de ARNm de una muestra para estudiar la expresión génica. Esta técnica fue desarrollada por Alwine, Kemp y Stark en 1979. Se diferencia de las técnicas de transferencia del sur y del oeste debido a varios pasos. Sin embargo, esta técnica también se realiza mediante electroforesis en gel, transferencia e hibridación con sondas marcadas específicas y detección. La técnica de transferencia Northern se realiza de la siguiente manera.
- El ARN se extrae de la muestra y se separa mediante electroforesis en gel.
- El ARN se transfiere del gel a una membrana de transferencia y se fija.
- La membrana se trata con una sonda marcada preparada a partir de ADNc o ARN (la sonda es complementaria a una secuencia específica de la muestra).
- La sonda se incuba con la membrana para que se una a una secuencia específica.
- Las sondas sueltas se lavan.
- Los fragmentos hibridados se detectan mediante una autorradiografía.
La transferencia de Northern es una herramienta importante en la detección y cuantificación de ARNm hibridado, el estudio de la degradación del ARN, la evaluación de la vida media del ARN, la detección del empalme del ARN, el estudio de la expresión génica, etc.
Figura 02: Transferencia Northern
¿Qué es el Western Blot?
Western blotting es un método para detectar una proteína específica de una mezcla de proteínas mediante el uso de anticuerpos marcados. Por lo tanto, el western blot también se conoce como inmunotransferencia. Esta técnica fue introducida por Towbin et al en 1979 y ahora se realiza de forma rutinaria en los laboratorios para el análisis de proteínas. Los pasos son los siguientes.
- Se extraen proteínas de la muestra
- Las proteínas se separan por su tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
- Las moléculas separadas se transfieren a una membrana de PVDF o de nitrocelulosa mediante electroporación
- La membrana está bloqueada por la unión no específica con los anticuerpos
- Las proteínas transferidas se unen con el anticuerpo primario (anticuerpos marcados con enzimas).
- La membrana se lava para eliminar los anticuerpos primarios unidos de forma no específica
- Los anticuerpos unidos se detectan añadiendo un sustrato y detectando el precipitado coloreado formado
Western blotting es útil en la detección de anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. El Western blot también se puede utilizar como prueba de confirmación de la infección por hepatitis B y como prueba definitiva de la enfermedad de las vacas locas.
Figura 03: Western Blot
¿Cuál es la diferencia entre Northern Southern y Western Blot?
Blotting del norte, del sur y del oeste |
|
| Tipo de molécula detectada | |
| Transferencia del norte | La transferencia Northern detecta una secuencia de ARN específica de una muestra de ARN. |
| Transferencia del Sur | La transferencia Southern detecta una secuencia de ADN específica a partir de una muestra de ADN. |
| Blotting occidental | Western blotting detecta una proteína específica de una muestra de proteína. |
| Tipo de gel | |
| Transferencia del norte | Esto utiliza gel de agarosa/formaldehído. |
| Transferencia del Sur | Esto utiliza un gel de agarosa. |
| Blotting occidental | Esto utiliza gel de poliacrilamida. |
| Método de transferencia | |
| Transferencia del norte | Esta es una transferencia capilar. |
| Transferencia del Sur | Esta es una transferencia capilar. |
| Blotting occidental | Esta es una transferencia eléctrica. |
| Sondas utilizadas | |
| Transferencia del norte | cDNA o RNA sondas marcadas radiactivamente o no radiactivamente. |
| Transferencia del Sur | Las sondas de ADN están marcadas radiactivamente o no radiactivamente. |
| Blotting occidental | Los anticuerpos primarios se utilizan como sondas. |
| Sistema de detección | |
| Transferencia del norte | Esto se hace usando una autorradiografía, o detección de luz o cambio de color. |
| Transferencia del Sur | Esto se hace usando una autorradiografía, detección de luz o cambio de color. |
| Blotting occidental | Esto se hace usando la detección de luz o cambio de color. |
Resumen: Transferencia del norte, del sur y del oeste
Blotting es una técnica especial desarrollada para la identificación de ADN, ARN o proteína específicos de las muestras. Hay tres procedimientos de transferencia separados, a saber, norte, sur y oeste, para detectar un tipo específico de molécula. La técnica de transferencia Northern está diseñada para detectar una secuencia de ARN específica a partir de una mezcla de ARN. La técnica de transferencia Southern permite la detección de una secuencia de ADN específica a partir de una muestra de ADN y la técnica de transferencia Western se desarrolla para identificar una proteína específica de una mezcla de proteínas.
