Diferencia clave: secuenciación de Sanger frente a pirosecuenciación
La secuenciación del ADN es muy importante para el análisis del ADN, ya que el conocimiento de la disposición correcta de los nucleótidos en una región particular del ADN revela mucha información importante al respecto. Existen diferentes métodos de secuenciación del ADN. La secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación son dos métodos diferentes de secuenciación de ADN ampliamente utilizados en biología molecular. La diferencia clave entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación es que la secuenciación de Sanger usa didesoxinucleótidos para terminar la síntesis de ADN para leer la secuencia de nucleótidos, mientras que la pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato al incorporar los nucleótidos y sintetizar la secuencia complementaria para leer el orden preciso de la secuencia.
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN de primera generación desarrollado por Frederick Sanger y sus colegas en 1977. También se conoce como secuenciación de terminación de cadena o secuenciación didesoxi, ya que se basa en la terminación de cadena por didesoxinucleótidos (ddNTP). Este método fue ampliamente utilizado durante más de 30 años hasta que se desarrolló la secuenciación de nueva generación (NGS). La técnica de secuenciación de Sanger permitió descubrir el orden correcto de los nucleótidos o la unión de un fragmento de ADN en particular. Se basa en la incorporación selectiva de ddNTP y la terminación de la síntesis de ADN durante la replicación del ADN in vitro. La ausencia de grupos OH 3' para continuar la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes es una característica única de los ddNTP. Por lo tanto, una vez que se une el ddNTP, el alargamiento de la cadena cesa y termina desde ese punto. Hay cuatro ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP) utilizados en la secuenciación de Sanger. Estos nucleótidos detienen el proceso de replicación del ADN cuando se incorporan a la hebra de ADN en crecimiento y dan como resultado longitudes variables de ADN corto. La electroforesis en gel capilar se usa para organizar estas cadenas cortas de ADN por sus tamaños en un gel como se muestra en la Figura 01.
Figura 1: Electroforesis en gel capilar de ADN corto sintetizado
Para la replicación in vitro del ADN, se deben proporcionar algunos requisitos. Son la enzima ADN polimerasa, el ADN molde, los cebadores de oligonucleótidos y los desoxinucleótidos (dNTP). En la secuenciación de Sanger, la replicación del ADN se realiza en cuatro tubos de ensayo separados junto con cuatro tipos de ddNTP por separado. Los desoxinucleótidos no se reemplazan totalmente por los respectivos ddNTP. Una mezcla del dNTP particular (por ejemplo, dATP + ddATP) se incluye en el tubo y se replica. Cuatro productos de tubos separados se procesan en un gel en cuatro pocillos separados. Luego, al leer el gel, la secuencia se puede construir como se muestra en la Figura 02.
Figura 02: Secuenciación de Sanger
La secuenciación de Sanger es una técnica importante que ayuda en muchas áreas de la biología molecular. El proyecto del genoma humano se completó con éxito con la ayuda de los métodos basados en la secuenciación de Sanger. La secuenciación de Sanger también es útil en la secuenciación del ADN objetivo, la investigación del cáncer y de enfermedades genéticas, el análisis de la expresión génica, la identificación humana, la detección de patógenos, la secuenciación microbiana, etc.
Hay varias desventajas de la secuenciación de Sanger:
- La longitud del ADN que se está secuenciando no puede superar los 1000 pares de bases
- Solo se puede secuenciar una hebra a la vez.
- El proceso lleva mucho tiempo y es costoso.
Por lo tanto, con el tiempo se desarrollaron nuevas técnicas de secuenciación avanzada para superar estos problemas. Sin embargo, la secuenciación de Sanger todavía está en uso debido a sus resultados altamente precisos hasta fragmentos de longitud de aproximadamente 850 pares de bases.
¿Qué es la pirosecuenciación?
La pirosecuenciación es una nueva técnica de secuenciación de ADN basada en la "secuenciación por síntesis". Esta técnica se basa en la detección de la liberación de pirofosfato tras la incorporación de nucleótidos. El proceso es empleado por cuatro enzimas diferentes: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa y dos sustratos adenosina 5' fosfosulfato (APS) y luciferina.
El proceso comienza con la unión del cebador con la plantilla de ADN monocatenario y la ADN polimerasa inicia la incorporación de nucleótidos complementarios a este. Cuando los nucleótidos se unen (polimerización de ácidos nucleicos), liberan grupos pirofosfato (dos grupos fosfato unidos) y energía. Cada adición de nucleótido libera una cantidad equimolar de pirofosfato. El pirofosfato se convierte en ATP por ATP sulfurilasa en presencia de sustrato APS. El ATP generado impulsa la conversión mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina, produciendo luz visible en cantidades que son proporcionales a la cantidad de ATP. La luz es detectada por un dispositivo de detección de fotones o por un fotomultiplicador y crea un pirograma. La apirasa degrada el ATP y los dNTP no incorporados en la mezcla de reacción. La adición de dNTP se realiza una vez. Dado que la adición de nucleótidos se conoce según la incorporación y detección de luz, se puede determinar la secuencia de la plantilla. El pirograma se utiliza para generar la secuencia de nucleótidos del ADN de la muestra, como se muestra en la Figura 03.
La pirosecuenciación es muy importante en el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido y en la secuenciación de tramos cortos de ADN. La alta precisión, flexibilidad, facilidad de automatización y procesamiento paralelo son las ventajas de la pirosecuenciación sobre las técnicas de secuenciación de Sanger.
Figura 03: Pirosecuenciación
¿Cuál es la diferencia entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación?
Secuenciación Sanger vs Pirosecuenciación |
|
| La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN basado en la incorporación selectiva de ddNTP por la ADN polimerasa y la terminación de la cadena. | La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN basado en la detección de la liberación de pirofosfato tras la incorporación de nucleótidos. |
| Uso de ddNTP | |
| Los ddNTP se utilizan para terminar la replicación del ADN | ddNTP no se utilizan. |
| Enzimas involucradas | |
| ADN polimerasa. | Se utilizan cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa. |
| Sustratos utilizados | |
| APS y Luciferina no se utilizan. | Se utilizan adenosina 5' fosfosulfato (APS) y luciferina. |
| Temperatura máxima | |
| Este es un proceso lento. | Este es un proceso rápido. |
Resumen: secuenciación de Sanger frente a pirosecuenciación
La secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación son dos métodos de secuenciación de ADN utilizados en biología molecular. La secuenciación de Sanger construye el orden de los nucleótidos en secuencia al terminar el alargamiento de la cadena, mientras que la pirosecuenciación construye el orden preciso de los nucleótidos en secuencia mediante la incorporación de nucleótidos y la detección de la liberación de pirofosfatos. Por lo tanto, la principal diferencia entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación es que la secuenciación de Sanger funciona en la secuenciación por terminación de cadena, mientras que la pirosecuenciación funciona en la secuenciación por síntesis.
