Diferencia clave: NGS frente a secuenciación de Sanger
La secuenciación de próxima generación (NGS) y la secuenciación de Sanger son dos tipos de técnicas de secuenciación de nucleótidos desarrolladas a lo largo del tiempo. El método de secuenciación de Sanger fue ampliamente utilizado durante muchos años y NGS lo reemplazó recientemente debido a sus ventajas. La diferencia clave entre NGS y Sanger Sequencing es que NGS funciona según el principio de secuenciar millones de secuencias simultáneamente de manera rápida a través de un sistema de secuenciación, mientras que Sanger Sequencing funciona según el principio de terminación de cadena debido a la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos por la enzima ADN polimerasa. durante la replicación del ADN y la separación de fragmentos resultante por electroforesis capilar.
¿Qué es la secuenciación de nucleótidos?
La información genética se almacena en las secuencias de nucleótidos del ADN o ARN de un organismo. El proceso de determinar el orden correcto de los nucleótidos (usando cuatro bases) en un fragmento dado (en un gen, grupo de genes, cromosoma y genoma completo) se conoce como secuenciación de nucleótidos. Es muy importante en estudios genómicos, estudios forenses, virología, sistemática biológica, diagnóstico médico, biotecnología y en muchos otros campos para analizar la estructura y función de los genes. Hay diferentes tipos de métodos de secuenciación desarrollados por científicos. Entre ellos, la secuenciación de Sanger desarrollada por Frederick Sanger en 1977 fue ampliamente utilizada y popularizada durante un largo período de tiempo hasta que la secuenciación de próxima generación la reemplazó.
¿Qué es NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) es un término utilizado para referirse a los procesos modernos de secuenciación de alto rendimiento. Describe una serie de diferentes tecnologías modernas de secuenciación que revolucionaron los estudios genómicos y la biología molecular. Esas técnicas son la secuenciación Illumina, la secuenciación Roche 454, la secuenciación Ion Proton y la secuenciación SOLiD (secuenciación por detección de ligadura de oligo). Los sistemas NGS son más rápidos y económicos. En los sistemas NGS se utilizan cuatro métodos principales de secuenciación de ADN, a saber; pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, secuenciación por ligación y secuenciación de iones semiconductores. Se puede secuenciar en paralelo un gran número de cadenas de ADN o ARN (millones). Permite la secuenciación de todo el genoma de los organismos en un período de tiempo breve, a diferencia de la secuenciación de Sanger, que lleva más tiempo.
NGS tiene muchas ventajas sobre el método Sanger de secuenciación convencional. Es un proceso de alta velocidad, más preciso y rentable que se puede realizar con un tamaño de muestra pequeño. NGS se puede utilizar en estudios metagenómicos, en la detección de variaciones dentro de un genoma individual debido a inserciones y deleciones, etc. y en el análisis de expresiones génicas.
Figura_1: Desarrollos en la secuenciación NGS
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación desarrollado por Frederick Sanger y sus colegas en 1977 para determinar el orden preciso de los nucleótidos de un fragmento de ADN determinado. También se conoce como secuenciación de terminación de cadena o secuenciación didesoxi. El principio de funcionamiento de este método es la terminación de la síntesis de cadena mediante la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos de terminación de cadena (ddNTP) como ddGTP, ddCTP, ddATP y ddTTP por la ADN polimerasa durante la replicación del ADN. Los nucleótidos normales tienen grupos OH 3' para la formación de un enlace fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes para continuar la formación de la cadena. Sin embargo, los ddNTP carecen de este grupo OH 3' y no pueden formar enlaces fosfodiéster entre nucleótidos. Por lo tanto, se detiene el alargamiento de la cadena.
En este método, el ADN monocatenario que se va a secuenciar sirve como cadena molde para la síntesis de ADN in vitro. Otros requisitos son el cebador de oligonucleótidos, los precursores de desoxinucleótidos y la enzima ADN polimerasa. Cuando se conocen los extremos flanqueantes del fragmento diana, los cebadores se pueden diseñar fácilmente para la replicación del ADN. Se realizan cuatro reacciones de síntesis de ADN separadas en cuatro tubos separados. Cada tubo tiene ddNTP independientes, junto con otros requisitos. A partir del nucleótido particular, se agrega una mezcla de dNTP y ddNTP. Asimismo, se realizan cuatro reacciones separadas en cuatro tubos con cuatro mezclas. Después de las reacciones, se realizan la detección de fragmentos de ADN y la conversión del patrón de fragmentos en información de secuencia. Los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan mediante electroforesis en gel. Si se utilizan nucleótidos radiactivos, el patrón de bandas en el gel de poliacrilamida se puede visualizar mediante autorradiografía. Cuando este método utiliza los didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia, se puede mitigar en la lectura del gel y pasar a través de un haz de láser para ser detectado por el detector fluorescente. Para evitar los errores que pueden surgir cuando una secuencia se lee a simple vista y se ingresa manualmente en una computadora, este método se convirtió en el uso de un secuenciador automatizado junto con la computadora.
Este es el método utilizado para secuenciar el ADN del proyecto Genoma Humano. Este método todavía está en uso con modificaciones avanzadas porque brinda información de secuencia precisa a pesar de ser un proceso costoso y lento.
Figura_2: Secuenciación de Sanger
¿Cuál es la diferencia entre NGS y secuenciación de Sanger?
NGS frente a secuenciación de Sanger |
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| Next Generation Sequencing (NGS) se refiere a procesos modernos de secuenciación de alto rendimiento. Describe varias tecnologías de secuenciación modernas diferentes | La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación desarrollado por Frederick Sanger para determinar el orden preciso de los nucleótidos de un fragmento de ADN dado. |
| Efectividad de costes | |
| NGS es un proceso más económico porque reduce el tiempo, la mano de obra y los productos químicos. | Este es un proceso costoso porque requiere tiempo, mano de obra y más productos químicos. |
| Velocidad | |
| Esto es más rápido ya que tanto la detección química como la detección de señales de muchas hebras ocurren en paralelo. | Esto requiere mucho tiempo, ya que la detección química y la detección de señales ocurren como dos procesos separados y solo se puede leer una hebra a la vez. |
| Fiabilidad | |
| NGS es fiable. | La secuenciación de Sanger es menos fiable |
| Tamaño de la muestra | |
| NGS requiere menos cantidad de ADN. | Este método necesita una gran cantidad de plantilla de ADN. |
| Bases de ADN por fragmento secuenciado | |
| El número de bases de ADN por fragmento secuenciado es inferior al método de Sanger | Las secuencias de generación son más largas que las secuencias NGS. |
Resumen: NGS frente a secuenciación de Sanger
NGS y Sanger Sequencing son técnicas de secuenciación de nucleótidos ampliamente utilizadas en Biología Molecular. La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación temprano que fue reemplazado por NGS. La principal diferencia entre NGS y Sanger Sequencing es que NGS es un proceso de alta velocidad, más preciso y rentable que la secuenciación de Sanger. Ambas técnicas crearon importantes brotes en Genética y Biotecnología.
