Diferencia clave: secuenciación de Maxam Gilbert frente a Sanger
Los nucleótidos son las unidades estructurales básicas y los componentes básicos del ADN. La molécula de ADN está compuesta por una cadena de polinucleótidos. Hay cuatro nucleótidos diferentes que se encuentran en el ADN. Estos nucleótidos están compuestos por cuatro bases nitrogenadas diferentes denominadas A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina). El orden de los nucleótidos en la molécula de ADN tiene una gran importancia ya que codifica una información genética importante para el crecimiento y desarrollo de los organismos. La secuenciación del ADN se refiere al proceso que determina la secuencia precisa de nucleótidos del ADN. Existen diferentes métodos de secuenciación del ADN. La secuenciación de Maxam Gilbert y la secuenciación de ADN de Sanger son dos métodos de secuenciación de ADN que pertenecen a la secuenciación de primera generación. El procedimiento de secuenciación de Maxam Gilbert determina la secuencia de bases mediante la escisión química de los fragmentos de ADN marcados en el extremo 5' preferentemente en cada uno de los cuatro nucleótidos y la electroforesis en gel. El procedimiento de secuenciación de Sanger determina la secuencia de nucleótidos mediante la síntesis de ADN monocatenario utilizando ADN polimerasa y didesoxinucleótidos y electroforesis en gel. Esta es la diferencia clave entre Maxam Gilbert y Sanger Sequencing.
¿Qué es la secuenciación de Maxam Gilbert?
La secuenciación de Maxam Gilbert, también conocida como método de secuenciación química, es una técnica desarrollada para determinar el orden de los nucleótidos en el ADN. Este método fue introducido por W alter Gilbert y Alan Maxam en 1976 y se hizo popular porque se puede realizar directamente con ADN purificado. El método de Maxam Gilbert pertenece a la primera generación de secuenciación de ADN y fue el primer método de secuenciación utilizado ampliamente por los científicos.
El principio básico de este método radica en la restricción de los fragmentos de ADN marcados en el extremo en bases específicas mediante condiciones y productos químicos específicos de la base y la separación de los fragmentos marcados mediante electroforesis, como se muestra en la figura 01. Los fragmentos se separan de acuerdo con a sus tamaños en el gel. Dado que los fragmentos están etiquetados, la secuencia de la molécula de ADN se puede deducir fácilmente.
El método Maxam gilbert utiliza productos químicos específicos de base para romper el ADN en bases específicas. Se utilizan dos productos químicos comunes llamados sulfato de dimetilo e hidracina para atacar selectivamente las purinas y las pirimidinas, respectivamente.
El método de secuenciación de Maxam Gilbert se realiza a través de varios pasos de la siguiente manera.
- Purificación de la secuencia de ADN mediante endonucleasas de restricción
- Etiquetado de los extremos de los fragmentos de ADN mediante la adición de fosfatos radiactivos
- Purificación de fragmentos marcados a partir de fragmentos no marcados mediante electroforesis en gel
- Separación del ADN marcado en el extremo en cuatro tubos y tratamiento con productos químicos básicos específicos por separado
- Electroforesis del contenido de cada tubo en líneas separadas sobre un gel y separación de fragmentos según su longitud.
- Detección de los fragmentos por autorradiografía.
Figura 01: Secuenciación de Maxam Gilbert
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación desarrollado por Frederick Sanger y sus colegas en 1977 para determinar la secuencia de bases de un fragmento de ADN determinado. También se conoce como secuenciación de terminación de cadena o método de secuenciación didesoxi. Este método funciona según el principio de la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos de terminación de cadena (ddNTP) como ddGTP, ddCTP, ddATP y ddTTP por la ADN polimerasa durante la síntesis de ADN monocatenario para terminar la formación de cadenas. Los didesoxinucleótidos carecen de grupos OH 3' para la formación de enlaces fosfodiéster con nucleótidos adyacentes. Por lo tanto, la formación de cadenas se detiene una vez que se incorpora un ddNTP a la cadena recién formada durante la secuenciación de Sanger.
En este método, se realizan cuatro reacciones de síntesis de ADN (PCR) separadas en cuatro tubos separados con un tipo de ddNTP. También se proporcionan otros requisitos para los tubos para PCR, incluidos cebadores, dNTP, polimerasa Taq, condiciones específicas, etc. Se realizan cuatro reacciones separadas en cuatro tubos con cuatro mezclas. Después de las reacciones de PCR, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan mediante electroforesis en gel. Luego, los fragmentos se visualizan utilizando un cebador marcado (radiactivo o fluorescente) o dNTP, como se muestra en la figura 02.
Figura 02: Secuenciación de Sanger
¿Cuál es la diferencia entre Maxam Gilbert y la secuenciación de Sanger?
Secuenciación de Maxam Gilbert vs Sanger |
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| La secuenciación de Maxam Gilbert es la primera técnica desarrollada para la secuenciación del ADN. | El método de secuenciación de Sanger se introdujo después del método de secuenciación de Maxam Gilbert. |
| Uso | |
| Este método rara vez se usa. | La secuenciación de Sanger se utiliza habitualmente para la secuenciación. |
| Uso de productos químicos peligrosos | |
| Utiliza productos químicos peligrosos. | El uso de productos químicos peligrosos es limitado en comparación con el método de Maxam Gilbert. |
| Etiquetado para detección | |
| Este método utiliza P32 radiactivo para marcar los extremos de los fragmentos de ADN. | La secuenciación de Sanger utiliza ddNTP marcados de forma radiactiva o fluorescente. |
Resumen – Maxam Gilbert vs Sanger Secuenciación
La secuenciación de Maxam Gilbert y Sanger son dos tipos de técnicas de secuenciación de ADN pertenecientes a la secuenciación de ADN de primera generación. La secuenciación de Maxam Gilbert es el primer método introducido para la secuenciación de ADN en 1976, y se realiza rompiendo los fragmentos de ADN marcados en el extremo mediante productos químicos específicos de base. Por lo tanto, se conoce como secuenciación química. El método de secuenciación de Sanger se introdujo en 1977 y se basa en las reacciones de terminación de cadena impulsadas por ddNTP. El método de secuenciación de Sanger es más popular que el método Maxam Gilbert debido a varias desventajas del método Maxam Gilbert, como el consumo excesivo de tiempo, el uso de productos químicos peligrosos, etc. Esta es la diferencia entre la secuenciación de Maxam Gilbert y la de Sanger.
