Diferencia clave: PCR frente a secuenciación de ADN
PCR y secuenciación de ADN son dos técnicas importantes en Biología Molecular. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el proceso que crea una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN. La secuenciación del ADN es la técnica que da como resultado el orden preciso de los nucleótidos de un fragmento de ADN dado. Esta es la diferencia clave entre la PCR y la secuenciación del ADN. La PCR es uno de los principales pasos involucrados en la secuenciación del ADN.
¿Qué es PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de amplificación de ADN utilizada en biología molecular. Produce de miles a millones de copias de un fragmento de ADN en particular. Este método fue desarrollado por Kary Mullis en 1983. En esta técnica, el fragmento de ADN que se amplifica sirve como molde y la enzima ADN polimerasa agrega nucleótidos complementarios al cebador que está disponible en la mezcla de PCR. Al final de la reacción de PCR, se sintetizan muchas copias del ADN de la muestra.
Hay diferentes componentes de la mezcla de PCR, incluidos el ADN, la ADN polimerasa (Taq polimerasa), los cebadores (cebadores directos e inversos), los nucleótidos (bloques de construcción del ADN) y un tampón. La PCR ocurre dentro de una máquina de PCR, y se debe cargar la mezcla de PCR correcta en la máquina, y se debe ejecutar el programa correcto. Esta técnica permite la producción de miles a millones de copias de una sección particular de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.
Las reacciones de PCR ocurren de manera cíclica para producir la cantidad visible de productos de PCR en un gel. Hay tres pasos principales involucrados en una reacción de PCR, a saber, desnaturalización, recocido de cebadores y extensión de cadena, como se muestra en la Figura 01. Estos tres pasos están ocurriendo a tres temperaturas diferentes. El ADN existe en forma de doble cadena por enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias. Antes de la implicación, el ADN de doble cadena debe separarse entre sí. Se hace dando una temperatura alta. A alta temperatura, el ADN de doble cadena se desnaturaliza en cadenas simples. Luego, los cebadores deberían acercarse a los extremos flanqueantes del fragmento específico o del gen del ADN. El cebador es un trozo corto de ADN monocatenario que es complementario a la secuencia objetivo. Los cebadores directos e inversos se hibridan con las bases complementarias en los extremos laterales del ADN de muestra desnaturalizado a la temperatura de hibridación. Las imprimaciones deben ser resistentes al calor. Una vez que los cebadores se hibridan con el ADN de la muestra, la enzima polimerasa taq inicia la síntesis de las nuevas hebras al agregar nucleótidos que son complementarios al ADN objetivo. La polimerasa Taq es una enzima termoestable aislada de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus. El tampón PCR mantiene las condiciones óptimas para la acción de la polimerasa taq. Estas tres etapas de las reacciones de PCR se repiten para producir la cantidad requerida de producto de PCR. Después de cada reacción de PCR, el número de copias de ADN se duplica. Por lo tanto, se puede observar una amplificación exponencial en la PCR. Los productos de la PCR se pueden observar mediante electroforesis en gel y se pueden purificar para estudios posteriores.
Figura 01: Pasos principales de una reacción de PCR
PCR es una herramienta valiosa en la investigación médica y biológica. La PCR tiene un valor especial en la ciencia forense, ya que puede amplificar el ADN para estudios de las pequeñas muestras de los delincuentes y hacer perfiles de ADN forense. La PCR se usa ampliamente en muchas áreas de la biología molecular, incluidas la genotipificación, la clonación de genes, la detección de mutaciones, la secuenciación de ADN, las micromatrices de ADN y las pruebas de paternidad, etc.
Figura 02: Reacción en cadena de la polimerasa
¿Qué es la secuenciación del ADN?
La secuenciación del ADN es la determinación de un orden preciso de los nucleótidos: adenina, guanina, citosina y timina en un fragmento de ADN determinado. La información genética se almacena en las secuencias de ADN utilizando el orden correcto de los nucleótidos. Por lo tanto, encontrar el orden preciso de los nucleótidos en un fragmento de ADN es muy importante para conocer la estructura y función de los genes.
El protocolo de secuenciación del ADN involucra diferentes procesos. El primer paso es el aislamiento del ADN interesado o ADN genómico de un organismo. Usando PCR (como se describe anteriormente), se debe amplificar la región deseada del ADN. El producto de PCR amplificado debe separarse mediante electroforesis en gel y purificarse. Los fragmentos amplificados se sirven como plantillas para la secuenciación. La secuenciación se puede realizar siguiendo la secuenciación de Sanger o el método de secuenciación de alto rendimiento. La secuenciación de Sanger requiere electroforesis capilar de los fragmentos de ADN resultantes. La determinación del orden correcto de los nucleótidos se puede realizar mediante la lectura manual de autorradiografías o utilizando secuenciadores de ADN automatizados.
La secuenciación de genes contribuyó al proyecto del genoma humano y facilitó el mapeo del genoma humano en 2003. En medicina forense, la secuenciación de ADN permitió la identificación de individuos que muestran secuencias de ADN únicas e identifican a los delincuentes. En medicina, la secuenciación del ADN se puede utilizar para detectar los genes responsables de enfermedades genéticas y de otro tipo, encontrar genes defectuosos y reemplazarlos por genes correctos. En la agricultura, la información de secuenciación del ADN de algunos microorganismos se utiliza para producir cultivos transgénicos con las características económicamente deseadas.
Figura 03: Secuenciación de ADN
¿Cuál es la diferencia entre PCR y secuenciación de ADN?
PCR frente a secuenciación de ADN |
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| El proceso PCR crea de miles a millones de copias del fragmento de ADN interesado. | La secuenciación del ADN es el proceso de determinar el orden preciso de los nucleótidos en un fragmento de ADN dado. |
| Resultado | |
| PCR crea de miles a millones de copias de un fragmento de ADN en particular | Esto da como resultado el orden correcto de las bases en un fragmento de ADN en particular. |
| Participación de los ddNTP | |
| PCR no requiere ddNTP. Utiliza dNTP. | La secuenciación del ADN requiere ddNTP para terminar la formación de cadenas. |
Resumen: PCR frente a secuenciación de ADN
PCR y secuenciación de ADN son herramientas muy importantes en muchas áreas de la Biología Molecular. La amplificación de los fragmentos de ADN se realiza mediante la técnica de PCR, mientras que el orden correcto de los nucleótidos de un fragmento de ADN se determina mediante la secuenciación del ADN. Esta es la diferencia entre la PCR y la secuenciación del ADN.
