Diferencia clave: RT PCR frente a QPCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica utilizada para amplificar una región específica de ADN in vitro. Debido a la invención de esta técnica por Kary Mullis en 1983, los científicos pueden hacer de miles a millones de copias de fragmentos de ADN específicos para fines de investigación. Actualmente se ha convertido en una técnica común y rutinaria en laboratorios clínicos y de investigación para una amplia variedad de aplicaciones. Existen variaciones de la técnica de PCR tradicional, como RT PCR, PCR anidada, PCR multiplex, Q PCR, RT – QPCR, etc. RT PCR y Q PCR son dos variaciones importantes de PCR. La diferencia clave entre RT PCR y Q PCR es que RT PCR se usa para detectar la expresión génica mediante la creación de transcripciones de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN, mientras que Q PCR se usa para medir cuantitativamente los productos de PCR en tiempo real usando colorantes fluorescentes.
¿Qué es la RT PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT PCR) es una variante de la PCR que se utiliza para detectar la expresión de ARN. Es un método muy importante para detectar la expresión de ARNm en tejidos. La RT PCR se emplea cuando el material de partida de la muestra es ARN. En la RT PCR, el ARNm molde se convierte primero en ADN complementario. Este paso es catalizado por la enzima transcriptasa inversa y el proceso se conoce como transcripción inversa. En segundo lugar, se emplea la PCR tradicional para el ADNc recién sintetizado para la amplificación.
RT PCR es una técnica altamente sensible que requiere una cantidad relativamente pequeña de muestra de ARN. La RT PCR se usa comúnmente en el diagnóstico y la cuantificación de especies de ARN, especialmente virus de ARN como el virus de la inmunodeficiencia humana y el virus de la hepatitis C.
Figura 01: Técnica de RT PCR
¿Qué es QPCR?
La PCR cuantitativa (QPCR) es una variante de la PCR que se utiliza para medir cuantitativamente los productos de la PCR. También se conoce como reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, ya que mide la amplificación del tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real. Es un método adecuado para determinar la cantidad de una secuencia diana o gen presente en una muestra. La característica interesante de QPCR es que combina la amplificación y la cuantificación real en un solo paso. Por lo tanto, la técnica QPCR puede eliminar la necesidad de electroforesis en gel en la detección. QPCR utiliza colorantes fluorescentes para etiquetar los productos de PCR durante las reacciones de PCR, lo que eventualmente conduce a la cuantificación directa. Cuando los productos de PCR se acumulan, las señales fluorescentes también se acumulan y serán medidas por la máquina en tiempo real. QPCR se puede combinar con RT PCR. Se conoce como RT - QPCR o QRT - PCR y se considera el método más potente, sensible y cuantitativo para la detección de niveles de ARN en células o tejidos.
SYBR Green y Taqman son dos métodos empleados para detectar o observar el proceso de amplificación de la PCR en tiempo real. El método SYBR Green se lleva a cabo utilizando un tinte fluorescente llamado SYBR green y detecta la amplificación uniendo el tinte para producir ADN de doble cadena. Taqman se lleva a cabo utilizando sondas de doble marcaje y detecta la amplificación por degradación de la sonda por la polimerasa Taq y liberaciones del fluoróforo como se muestra en la figura 02. Ambos métodos monitorean el progreso del proceso de amplificación e informan la cantidad del producto en tiempo real.
La PCR en tiempo real tiene una amplia variedad de aplicaciones, como la cuantificación de la expresión génica, el análisis de microARN y ARN no codificante, el genotipado de SNP, la detección de variantes en el número de copias, la detección de mutaciones raras, la detección de organismos genéticamente modificados, la detección de agentes infecciosos, etc.
Figura 02: Técnica de PCR cuantitativa
¿Cuál es la diferencia entre RT PCR y QPCR?
RT PCR frente a QPCR |
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| RT PCR es una técnica utilizada para detectar la expresión génica por amplificación. | QPCR es una técnica que amplifica el ADN y cuantifica los productos de la PCR en tiempo real. |
| Implicación de la enzima transcriptasa inversa | |
| La enzima transcriptasa inversa se usa para RT PCR. | La enzima transcriptasa inversa no se usa para QPCR. |
| Uso de moléculas marcadas con fluorescencia | |
| Los colorantes o sondas marcados con fluorescencia no se utilizan para la RT PCR. | Los colorantes o sondas marcados con fluorescencia se utilizan para QPCR. |
| Cuantificación del producto PCR | |
| A menos que se combine con QPCR, la RT PCR no cuantifica el producto de la PCR. | QPCR mide cuantitativamente el producto de PCR. |
| Material de partida | |
| El material de partida es ARNm. | El material de partida es el ADN. |
| Síntesis de ADNc | |
| Se produce ADN complementario durante la RT PCR. | No se produce ADN complementario durante la QPCR. |
Resumen: RT PCR frente a QPCR
RT PCR y QPCR son dos versiones de la PCR tradicional. La técnica RT PCR se realiza para muestras de ARNm y está impulsada por la transcripción inversa y la producción de ADNc. QPCR se utiliza para cuantificar los productos de PCR durante los ciclos térmicos de PCR en tiempo real utilizando tintes fluorescentes o sondas marcadas. En QPCR, la cantidad de producto de PCR está representada por las señales fluorescentes emitidas por la muestra. RT PCR se usa popularmente como un proceso de amplificación, mientras que QPCR se usa comúnmente como un proceso de cuantificación. Esta es la diferencia entre RT PCR y QPCR.
