Diferencia clave: clonación de genes frente a PCR
La síntesis de muchas copias de ADN a partir de un fragmento de ADN específico se denomina amplificación de ADN. Hay dos procesos principales de amplificación de ADN, a saber, la clonación de genes y la PCR. La diferencia clave entre la clonación de genes y la PCR es que la clonación de genes produce múltiples copias de un gen específico in vivo al construir un ADN recombinante y crecer dentro de una bacteria huésped, mientras que la PCR produce millones de copias de un fragmento de ADN específico in vitro que se somete a ciclos repetidos de desnaturalización y síntesis.
¿Qué es la clonación de genes?
La clonación de genes es una técnica empleada para localizar y multiplicar un gen específico del ADN genómico extraído de un organismo mediante la construcción de ADN recombinante. El ADN genómico contiene miles de genes diferentes codificados para proteínas. Cuando se extrae el ADN, incluye todos los genes posibles que puede portar. La técnica de clonación de genes ha permitido la detección de un gen específico a partir del ADN total. Por lo tanto, la clonación de genes es una herramienta importante en biología molecular.
La creación de una biblioteca genómica de un organismo es esencial en la clonación de genes si no hay ninguna pista sobre la ubicación del gen relevante en el ADN. Una biblioteca genómica se crea siguiendo los siguientes pasos.
Paso 1: Extracción del ADN total de un organismo que contiene el gen deseado.
Paso 2: Restricción de la digestión del ADN extraído para producir pequeños fragmentos manejables. Este paso lo facilitan las endonucleasas de restricción.
Paso 3: Selección de un vector adecuado y apertura del ADN del vector utilizando las mismas endonucleasas de restricción. Los plásmidos bacterianos se usan comúnmente como vectores para transportar ADN extraño. Los plásmidos son pequeños círculos de ADN ubicados dentro de las bacterias.
Paso 4: Combinación del vector de ADN y el ADN fragmentado para producir una molécula de ADN recombinante. Este paso se rige por la ADN ligasa.
Paso 5: Transferencia de moléculas de ADN recombinante a la bacteria huésped. Este paso se conoce como transformación y se realiza mediante un choque térmico.
Paso 5: Detección de células bacterianas transformadas en un medio de cultivo. Se obtiene una población mixta de células huésped transformadas y no transformadas al final del proceso de transformación. Como gen de interés se incluye solo en células huésped transformadas. Por lo tanto, es necesario seleccionar células transformadas. La selección se realiza utilizando medios selectivos que contienen antibióticos. Solo las células transformadas crecen en este medio de cribado que permite la selección.
Paso 6: Crecimiento de bacterias para producir una biblioteca de genes. En este paso, las células huésped transformadas se introducen en medios de cultivo frescos que proporcionan requisitos de crecimiento óptimos. Las colonias totales en las placas de cultivo representan la biblioteca genómica de ese organismo.
Paso 7: La molécula de ADN recombinante que contiene el gen de interés debe examinarse a partir de miles de fragmentos clonados de ADN recombinante. Puede lograrse mediante el uso de sondas que marcan el gen específico o la proteína específica que resulta de ese gen.
Una vez que se identifica el gen interesado que contiene la colonia bacteriana del total de colonias, es posible hacer millones de copias del plásmido recombinante que contiene el gen.
La clonación de genes se usa para establecer bibliotecas de genes, producir proteínas especiales, vitaminas, antibióticos, hormonas, secuenciar y mapear genomas de los organismos, hacer múltiples copias de ADN de individuos en medicina forense, etc.
Figura_1: Clonación de genes
¿Qué es PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que genera un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular. La amplificación exponencial de una secuencia de ADN específica se obtiene mediante PCR en condiciones in vitro. Esta técnica es una herramienta muy poderosa en Biología Molecular ya que puede multiplicar una pequeña muestra de ADN en una cantidad utilizable. La PCR fue presentada por Kary Mullis en 1983 y esta invención ganadora de un premio supuso un gran avance en la biología molecular.
La técnica
PCR sigue reacciones de PCR repetidas como se muestra en la Figura 02. Una reacción de PCR consta de tres pasos principales que ocurren a tres temperaturas diferentes; desnaturalización del ADN de doble cadena a 94 0C, hibridación de cebadores a 68 0C y alargamiento de cadena a 72 0 C. Por lo tanto, cuando se realiza la PCR, la fluctuación de la temperatura debe mantenerse al máximo para una replicación adecuada. La PCR se realiza en una máquina de PCR dentro de tubos de PCR. Los tubos de PCR se cargan con las mezclas de PCR correctas que contienen ADN molde, polimerasa Taq, cebadores, dNTP y tampón. La desnaturalización de la muestra de ADN de doble cadena en ADN de cadena sencilla se realiza rompiendo los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias a 94 – 98 0C. Luego se exponen las hebras simples de ADN molde para los cebadores. Se debe proporcionar un par de cebadores (hacia adelante y hacia atrás), y deben ser termoestables para tolerar altas temperaturas. Los cebadores son secuencias cortas de ADN monocatenarias complementarias a los extremos del fragmento de ADN diana. Los cebadores sintéticos se utilizan en PCR. Los cebadores se unen a las bases complementarias del ADN de la muestra e inician la síntesis de una nueva hebra. Este paso es catalizado por una enzima llamada polimerasa Taq; una enzima polimerasa de ADN termoestable aislada de Thermus auqaticus. Cuando los cebadores y los nucleótidos (bloques de construcción) están disponibles, la polimerasa Taq construye la nueva hebra de ADN complementaria al ADN molde. Al final del programa de PCR, se observa el fragmento de ADN amplificado mediante electroforesis en gel. Si se requieren más análisis, el producto de PCR se purifica del gel.
PCR es muy útil para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades genéticas y adquiridas, identificación de delincuentes (en el campo de la ciencia forense), estudio de la estructura y función de un segmento específico de ADN, secuenciación y mapeo de genomas de organismos, etc. La PCR se ha convertido en una técnica de laboratorio de rutina en los laboratorios de investigación médica y de biología molecular entre los científicos, ya que tiene una amplia variedad de aplicaciones.
Figura_2: Reacción en cadena de la polimerasa
¿Cuál es la diferencia entre la clonación de genes y la PCR?
Clonación de genes frente a PCR |
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| La clonación de genes es el proceso de hacer múltiples copias de un gen específico in vivo a través del ADN recombinante y transformarlo en una bacteria huésped. | La técnica de PCR produce múltiples copias de una secuencia de ADN particular in vitro a través de ciclos repetidos de reacciones de PCR. |
| Requisito para construir ADN recombinante | |
| Se produce ADN recombinante para localizar el gen. | No se produce ADN recombinante. |
| Necesidad de mano de obra | |
| Este proceso requiere mucha mano de obra. | No se necesita mano de obra intensiva. |
| Proceso in vivo o in vitro | |
| La construcción del ADN recombinante es in vitro y la amplificación del ADN es in vivo. | La amplificación del ADN ocurre completamente in vitro. |
Resumen: clonación de genes frente a PCR
La clonación de genes y la PCR son dos métodos utilizados para la amplificación del ADN. La PCR es un proceso in vitro que realiza múltiples copias de ADN de un fragmento de ADN particular sin utilizar ADN recombinante y un organismo huésped. La clonación de genes es principalmente un proceso in vivo que da como resultado múltiples copias de un gen interesado dentro del organismo huésped mediante la construcción de ADN recombinante. Esta es la diferencia entre la clonación de genes y la PCR.
