Diferencia clave: Microarray frente a secuenciación de ARN
El transcriptoma representa todo el contenido de ARN presente en una célula, incluidos ARNm, ARNr, ARNt, ARN degradado y ARN no degradado. Perfilar el transcriptoma es un proceso importante para comprender los conocimientos de las células. Existen varios métodos avanzados para el perfilado del transcriptoma. La secuenciación de microarrays y ARN son dos tipos de tecnologías desarrolladas para analizar el transcriptoma. La diferencia clave entre la micromatriz y la secuenciación de ARN es que la micromatriz se basa en el potencial de hibridación de sondas etiquetadas prediseñadas con secuencias de ADNc objetivo, mientras que la secuenciación de ARN se basa en la secuenciación directa de hebras de ADNc mediante técnicas de secuenciación avanzadas como NGS. La micromatriz se realiza con el conocimiento previo sobre las secuencias y la secuenciación del ARN se realiza sin el conocimiento previo sobre las secuencias.
¿Qué es Microarray?
Microarray es un método sólido, fiable y de alto rendimiento que los científicos utilizan para la elaboración de perfiles de transcriptomas. Es el enfoque más popular para el análisis de transcripciones. Es un método de bajo costo, que depende de las sondas de hibridación.
La técnica comienza con la extracción del ARNm de la muestra y la construcción de una biblioteca de ADNc a partir del ARN total. Luego se mezcla con sondas prediseñadas marcadas con fluorescencia sobre una superficie sólida (matriz de puntos). Las secuencias complementarias se hibridan con las sondas marcadas en la micromatriz. Luego, la micromatriz se lava y se analiza, y se cuantifica la imagen. Los datos recopilados deben analizarse para obtener los perfiles de expresión relativos.
Se supone que la intensidad de las sondas de micromatrices es proporcional a la cantidad de transcritos en la muestra. Sin embargo, la precisión de la técnica depende de las sondas diseñadas, el conocimiento previo de la secuencia y la afinidad de las sondas para la hibridación. Por lo tanto, la tecnología de microarrays tiene limitaciones. La técnica de micromatriz no se puede realizar con transcripciones de baja abundancia. No logra diferenciar isoformas e identificar variantes genéticas. Dado que este método depende de la hibridación de las sondas, en la técnica de microarrays se producen algunos problemas relacionados con la hibridación, como la hibridación cruzada, la hibridación no específica, etc.
Figura 01: Micromatriz
¿Qué es la secuenciación de ARN?
La secuenciación de escopeta de ARN (RNA seq) es una técnica de secuenciación del transcriptoma completo desarrollada recientemente. Es un método rápido y de alto rendimiento para la creación de perfiles de transcriptomas. Cuantifica directamente la expresión de genes y da como resultado una investigación profunda del transcriptoma. RNA seq no depende de sondas prediseñadas ni del conocimiento previo de las secuencias. Por lo tanto, el método RNA seq tiene una alta sensibilidad y capacidad para detectar nuevos genes y variantes genéticas.
El método de secuenciación de ARN se realiza a través de varios pasos. El ARN total de la célula debe aislarse y fragmentarse. Luego, usando transcriptasa inversa, se debe preparar una biblioteca de cDNA. Cada hebra de ADNc debe ligarse con adaptadores. Luego, los fragmentos ligados deben amplificarse y purificarse. Finalmente, utilizando un método NGS, se debe realizar la secuenciación del ADNc.
Figura 02: Secuenciación de ARN
¿Cuál es la diferencia entre Microarray y secuenciación de ARN?
Microarray frente a secuenciación de ARN |
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| Microarray es un método robusto, confiable y de alto rendimiento. | La secuenciación del ARN es un método preciso y de alto rendimiento. |
| Coste | |
| Este es un método de bajo costo. | Este es un método costoso. |
| Análisis de un gran número de muestras | |
| Esto facilita el análisis de un gran número de muestras simultáneamente. | Esto facilita el análisis de un gran número de muestras. |
| Análisis de datos | |
| El análisis de datos es complejo. | Se generan más datos con este método; por lo tanto, el proceso es más complejo. |
| Conocimiento previo de secuencias | |
| Este método se basa en sondas de hibridación, por lo que se requiere un conocimiento previo de las secuencias. | Este método no depende del conocimiento previo de la secuencia. |
| Variaciones estructurales y nuevos genes | |
| Este método no puede detectar variaciones estructurales ni genes nuevos. | Este método puede detectar variaciones estructurales como la fusión de genes, empalmes alternativos y genes nuevos. |
| Sensibilidad | |
| Esto no puede detectar diferencias en la expresión de isoformas, por lo que tiene una sensibilidad limitada. | Esto tiene alta sensibilidad. |
| Resultado | |
| Esto solo puede resultar en niveles de expresión relativos. Esto no proporciona una cuantificación absoluta de la expresión génica. | Da niveles de expresión absolutos y relativos. |
| Reanálisis de datos | |
| Esto debe volver a ejecutarse para volver a analizarlo. | Los datos de secuenciación se pueden volver a analizar. |
| Necesidad de Personal Específico e Infraestructura | |
| No se requiere infraestructura ni personal específicos para los microarrays. | Infraestructura y personal específicos necesarios para la secuenciación de ARN. |
| Problemas técnicos | |
| La técnica de micromatrices tiene problemas técnicos como la hibridación cruzada, la hibridación no específica, la tasa de detección limitada de sondas individuales, etc. | La técnica de secuenciación de ARN evita problemas técnicos como la hibridación cruzada, la hibridación no específica, la tasa de detección limitada de sondas individuales, etc. |
| Sesgos | |
| Este es un método sesgado ya que depende de la hibridación. | El sesgo es bajo en comparación con el microarreglo. |
Resumen: Microarray frente a secuenciación de ARN
Los métodos de secuenciación de ARN y micromatrices son plataformas de alto rendimiento desarrolladas para el perfilado de transcriptomas. Ambos métodos producen resultados que están altamente correlacionados con los perfiles de expresión génica. Sin embargo, la secuenciación de ARN tiene ventajas sobre los microarrays para el análisis de la expresión génica. La secuenciación de ARN es un método más sensible para la detección de transcritos de baja abundancia que los microarrays. La secuenciación de ARN también permite la diferenciación entre isoformas y la identificación de variantes genéticas. Sin embargo, la micromatriz es la elección común de la mayoría de los investigadores, ya que la secuenciación del ARN es una técnica nueva y costosa que presenta desafíos de almacenamiento de datos y análisis de datos complejos.
